Los científicos de la Universidad Estatal de Pensilvania y del Departamento de Agricultura de EEUU han utilizado la tecnología CRISPR/Cas de vanguardia para desarrollar una prueba de diagnóstico que podría permitir el diagnóstico temprano del greening de los cítricos, o Huanglongbing, una enfermedad grave que amenaza la producción mundial de cítricos, con una venta de frutas frescas y zumos valorada en aproximadamente 17.000 millones de dólares.
En un estudio publicado recientemente en la revista Phytopathology, los investigadores demostraron que el nuevo ensayo puede detectar la presencia del agente causal de la enfermedad, la bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus, abreviada como CLas, a un nivel de sensibilidad de 100 a 1.000 veces mayor que el de uso común. prueba de diagnóstico, reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa o qPCR.
El greening de los cítricos, a veces denominado HLB, se describió en Asia hace más de un siglo y llegó a Florida en 2005. Desde entonces, la enfermedad ha diezmado la cosecha de naranjas de ese estado, reduciendo la producción en más del 70%. El patógeno también se ha extendido a Texas, California, Georgia y Luisiana, amenazando la industria de los cítricos de Estados Unidos, valorada en 3.350 millones de dólares.
Transmitida por un insecto conocido como psílido asiático de los cítricos o el injerto de tejidos infectados, la CLas no daña a las personas ni a los animales, pero una vez que un árbol de cítricos se infecta, no existe cura para la enfermedad. Según el USDA, los árboles infectados muestran un amarilleo asimétrico de las hojas y las venas de las hojas, lo que se conoce como "moteado con manchas", y producen una fruta verde, deforme y amarga, inadecuada para los mercados de frutas frescas o jugos. La mayoría de los árboles infectados mueren a los pocos años.
Los científicos dicen que la mejor esperanza de reducir la propagación del greening de los cítricos es eliminar rápidamente los árboles enfermos. Como resultado, la detección temprana del patógeno es crucial porque los árboles infectados pueden actuar como reservorios de enfermedades durante meses o años antes de mostrar síntomas visibles.
Para abordar la necesidad de un diagnóstico temprano, los investigadores implementaron CRISPR/Cas, una poderosa tecnología de edición de genes que recientemente se ha adaptado como una herramienta de diagnóstico molecular, señaló el coautor del estudio Yinong Yang, profesor de patología vegetal en la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Estatal de Pensilvania.
"Hasta ahora, se han utilizado diversas tecnologías, como la detección olfativa canina y la qPCR, para diagnosticar y confirmar la infección por CLas", dijo Yang, quien también está afiliado a los Institutos Huck de Ciencias de la Vida. "Pero estas herramientas a menudo son inadecuadas para la detección temprana de CLas en tejido asintomático, donde hay bajas cantidades de bacterias, y no son adecuadas para el diagnóstico de alto rendimiento en el campo".
CRISPR significa repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas. La tecnología puede modificar el genoma de un organismo mediante la entrega precisa de una enzima de corte de ADN, Cas, a una región específica de ADN. La modificación resultante puede eliminar o reemplazar partes específicas de ADN, promoviendo o inhabilitando ciertos rasgos. CRISPR / Cas tiene muchas aplicaciones biomédicas y agrícolas potenciales, como el tratamiento de enfermedades genéticas o el desarrollo de cultivos más resistentes.
Los investigadores adaptaron el sistema CRISPR/Cas para desarrollar un ensayo basado en una plataforma conocida como DETECTR, que significa transinformador CRISPR dirigido a endonucleasas de ADN. En este ensayo, una variante de Cas llamada Cas12a se mezcla con ARN CRISPR diseñado para buscar ADN CLas y una molécula sintética conocida como oligonucleótido indicador fluorescente. Si el ADN de CLas está presente, Cas12a escinde tanto el ADN del patógeno como el oligonucleótido informador, lo que permite la generación de una señal fluorescente para la detección.
Los investigadores informan que este ensayo fue altamente sensible y específico en la detección de ADN CLas, utilizando un lector de microplacas para lecturas de fluorescencia o una tira de flujo lateral para un resultado visual que indica la presencia de una secuencia objetivo, similar en concepto a una prueba de embarazo casera.
"El ensayo detectó y confirmó con éxito la presencia de ácidos nucleicos CLas en muestras infectadas recolectadas en Florida", dijo el autor principal del estudio, Matthew Wheatley, investigador postdoctoral en patología vegetal y microbiología ambiental de la Universidad Estatal de Pensilvania.
"Probamos muestras de ADN de naranja dulce, pomelo, pomelo y bígaro infectados y del vector psílido de los cítricos, así como de muestras de pomelo y psílido no infectados como controles negativos", dijo Wheatley. "El ensayo CLas DETECTR confirmó que todas las muestras infectadas fueron positivas para CLas en comparación con los controles negativos. Curiosamente, dos muestras de ADN de pomelo que previamente dieron negativo a CLas mediante una prueba qPCR mostraron una débil positividad para CLas en el ensayo DETECTR".
Yang señaló que la compatibilidad del ensayo DETECTR con la tecnología de flujo lateral es prometedora para proporcionar pruebas rápidas y económicas para HLB en el campo.
"Estos resultados muestran que las estrategias de detección basadas en CRISPR/Cas tienen la capacidad de mejorar los diagnósticos actuales del greening de los cítricos al proporcionar una detección específica y altamente sensible de ácidos nucleicos CLas", dijo. "La mejora en la sensibilidad de detección y la facilidad de uso en comparación con las metodologías tradicionales como qPCR posicionan el ensayo CLas DETECTR como una herramienta prometedora para el diagnóstico del HLB en regiones donde ocurre el patógeno CLas".
Yong-Ping Duan, fitopatólogo investigador del Laboratorio de Investigación Hortícola de los Estados Unidos del Servicio de Investigación Agrícola del USDA, en Fort Pierce, Florida, también fue miembro del equipo de investigación.
La Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Estatal de Pensilvania, el Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura del USDA y el Servicio de Investigación Agrícola del USDA apoyaron este trabajo.
