Enfermedades. Técnicas de diagnóstico de enfermedades en los cultivos

1.- Introducción
2.- Generalidades sobre el diagnóstico
3.- Procedimiento de diagnóstico
4.- Técnicas de diagnóstico
4.1- Postulados de Koch
4.2- Aislamiento en medios de cultivo
4.3- Marcadores moleculares
4.3.1- Marcadores morfológicos
4.3.2- Marcadores bioquímicos
4.3.3- Marcadores genéticos
5.- Ejemplos de diagnóstico de enfermedades en hortícolas
5.1- Enfermedad de suelo en pimiento
5.2- Enfermedad transmitida por un vector en lechuga
5.3- Enfermedad aérea en calabacín
5.4- Enfermedad aérea en tomate
6.- Bibliografía

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1.- Introducción

Las enfermedades de las plantas son una de las principales causas de pérdidas de producción de los cultivos en todo el mundo. Para un buen manejo de las enfermedades que afectan a nuestros cultivos debemos realizar un diagnóstico precoz y correcto del agente causal para poder elegir la estrategia de control más adecuada y, así, reducir las fuentes de infección de los patógenos y su diseminación por toda la parcela o incluso a otras parcelas colindantes.

2.- Generalidades sobre el diagnóstico de enfermedades en el cultivo

Para un diagnóstico correcto de la causa o causas que afectan a nuestro cultivo debemos tener en cuenta lo siguiente:

1. Tipo de síntomas observables en el cultivo enfermo (clorosis, necrosis, pérdida de turgencia, pudrición blanda, etc.).
2. Partes del cultivo afectado (hoja, tallo, fruto o raíces)
3. Presencia de microorganismos o insectos en el cultivo enfermo (micelio hongo, insectos chupadores o masticadores como trips, pulgón, mosca blanca y coleópteros)
4. Condiciones de desarrollo del cultivo (temperatura, humedad, estado nutricional, estado fenológico, resistencias, prácticas agrícolas, métodos de control empleados, etc.)
5. Distribución de las plantas afectadas dentro de la parcela (localizada o no localizada)

El diagnóstico de enfermedades debe ser rápido y preciso para evitar el uso incorrecto de los productos químicos (Rosales, 2003).

Los síntomas de una enfermedad son características externas o internas de la enfermedad expresadas por la planta huésped. Los síntomas visuales, por sí solos, no constituyen un diagnóstico certero de dicha enfermedad, puesto que varios patógenos pueden producir similar sintomatología en el huésped. Por lo que es importante analizar en profundidad la causa de la enfermedad, en un laboratorio, para descartar posibles microorganismos oportunistas que en realidad enmascaran la verdadera causa de la enfermedad.

Entre los agentes bióticos causales de enfermedades más importantes, desde el punto de vista económico, nos encontramos los hongos (Pythium ssp., Rhizoctonia spp., Botrytis spp., Fusarium spp., Oidio, Mildiu, Roya, Phytophthora spp. y Verticillium spp.) Los síntomas que producen suelen ser muy diversos, desde manchas necróticas o clorosis en hojas, pérdida de turgencia hasta la pudrición parcial o total de frutos o raíces. En algunos casos, el desarrollo del hongo es fácilmente observable en el cultivo y fácilmente reproducible en el laboratorio, pero en otros casos no lo son (Olpidium spp. en lechuga, y Mildiu u Oídio).

Las bacterias son el segundo grupo de agentes bióticos causales de enfermedades que más pérdidas económicas producen. Ello es debido a que provocan un rápido deterioro del cultivo y su efecto puede ser devastador. En la actualidad, hay más de 60 especies de bacterias que afectan a nuestros cultivos, como Xanthomonas spp., Pseudomonas spp. o Claribacter spp. Los síntomas que producen suelen ser manchas angulares, pecas o cancro. La mayoría de las bacterias son bastante específicas en cuanto al cultivo que tienen como huésped, como es el caso de Pseudomonas syringae que produce unas manchas necróticas en los foliolos rodeado de un alo clorótico muy característico, en tomate (Blancard, 1990).

En cuanto a los virus, son el tercer grupo de microorganismos que producen más pérdidas económicas en los cultivos de hoy día. No son visibles a simple vista ni con un microscopio óptico, por lo que es preciso el uso de un microscopio electrónico. Los síntomas más característicos que producen sueles ser mosaicos y moteados en hojas y frutos, clorosis y bandeado de venas en hojas, anillos cloróticos o necróticos en hojas, tallo y frutos, deformación de frutos, acucharamiento de hojas, brotación poco uniforme y abortos florales o de frutos.

A las enfermedades causadas por agentes abióticos se les denomina desórdenes y pueden deberse a un mal manejo del riego, ausencia o exceso de algún nutriente, temperatura o pH inadecuados o fitotoxicidad.

Las condiciones climáticas y de cultivo también condicionan la aparición y propagación de enfermedades en los cultivos. Una alta humedad ambiental o en el suelo junto con una falta de aireación favorecerá la aparición y diseminación de hongos y bacterias en la parcela.

3.- Procedimiento de diagnóstico de enfermedades en los cultivos

El proceso de diagnóstico diferencia si la enfermedad es causada por un agente patógeno o por alteraciones abióticas, las cuales precisan de que no se observa presencia de agentes patógenos en las plantas. En ambos casos se precisa de un diagnóstico preliminar del problema. Hay que examinar la parcela “in situ”, recopilar información sobre la especie o variedad del cultivo enfermo, resistencia a enfermedades, las prácticas agrícolas realizadas, como la fertilización, riego y control químico, la distribución de las plantas enfermas en la parcela, si está localizada la zona o no, y se examinan los síntomas y los órganos afectados en plantas individuales. Una vez recogidos todos estos datos, se toman muestras de plantas sanas y enfermas y se llevan al laboratorio para la identificación correcta del agente causal de la enfermedad.

En el diagnóstico de confirmación convencional se usan técnicas de aislamiento en medios de cultivo selectivos, para la observación macro y microscópica del patógeno, y la prueba de patogenicidad. En el caso de las bacterias, además de las observaciones macro y microscópicas del microorganismo se necesitaban pruebas bioquímicas (Flores- Olivas, et al, 1997). Pero estas técnicas requieren de experiencia y de un nivel de conocimiento del patógeno muy alto, por lo que el uso de nuevas técnicas, como las serológicas (ELISA) o moleculares (PCR, RFLP, AFLP, etc.), facilitan esta labor de identificación que en la actualidad se hace de una forma rápida y precisa.

4.- Técnicas de diagnóstico de enfermedades en las plantas

4.1- Postulados de Koch

La aplicación de los postulados de Robert Koch (1890) a los estudios microbiológicos marcó un punto de inflexión en la microbiología y fueron imprescindibles para identificar a la mayoría de los patógenos causantes de enfermedades en plantas que conocemos hoy día. Estos postulados son:

1. El microorganismo debe estar presente en todos los individuos enfermos.
2. El microorganismo debe poder aislarse del hospedante y crecer en cultivo puro.
3. La inoculación del microorganismo crecido en cultivo puro debe probar la aparición de síntomas específicos de la enfermedad en cuestión.
4. El microorganismo debe ser reaislado del hospedante infectado de forma experimental.

Normalmente, la aplicación de estos postulados nos permite determinan con exactitud el patógeno causante de la enfermedad, pero hay excepciones en las que algunos microorganismos no se adaptan a estos postulados, principalmente, porque no son reproducibles en el laboratorio, como es el caso de Olpidium sp., y no se han podido identificar hasta la aplicación de nuevas técnicas moleculares a la microbiología.

4.2- Aislamiento en medios de cultivo

Los medios de cultivo selectivos, como su propio nombre indica, seleccionan los microrganismos que crecen en ellos y, además, permiten cuantificar las colonias y observar las formas reproductivas de los hongos para su correcta identificación. Estos medios selectivos pueden contener ciertos componentes que favorezcan el crecimiento de ciertos microorganismos o la inhibición de otros, como pueden ser los antibióticos que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias.

4.3 Marcadores moleculares

Los marcadores moleculares son moléculas o segmentos de ADN que se consideran como marcas de referencia de una determinada población o especie de patógeno.

Los marcadores moleculares que existen hoy día son: morfológicos, bioquímicos (isoenzimáticos) y de ADN (genéticos).

4.3.1 Marcadores morfológicos

Los marcadores morfológicos en plantas son: altura, diámetro, formas o color, etc. sin embargo, en los hongos son difíciles de observar, aunque se han utilizado en estudios de laboratorio sobre la variación y recombinación genética (Michelmore y Hulbert, 1987). Son caracteres poco estables y que se ven afectados por las condiciones ambientales (Egger, 1992).

4.3.2 Marcadores bioquímicos

Las isoenzimas comenzaron a usarse en la década de los setenta para el estudio de los hongos fitopatógenos, debido a su especificidad por el estado de desarrollo y especie del individuo. Con estas técnicas se pueden procesar gran cantidad de muestras y detectar variaciones dentro de una población, pero están condicionadas por ciertos factores como la edad, tipo de estructura y condiciones de crecimiento del individuo que tenemos que tener en cuenta a la hora de analizar los resultados.
La detección de la presencia de patógenos con inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) y la microscopia por inmunofluorescencia (Martinelli et al., 2015), tienen la desventaja de ser costosos por la producción de anticuerpos y los equipos de detección, además de la baja especificidad de los anticuerpos dando falsos positivos, por lo que son técnicas más adecuadas para la detección de virus (Fang y Ramasamy, 2015).

4.3.3 Marcadores genéticos

En la actualidad, los marcadores genéticos basados en el ADN son los más utilizados para el diagnóstico de las enfermedades vegetales y el método de la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la secuenciación los más utilizados, por ser directos y rápidos para indicar si el patógeno está presente o no.

La PCR se realiza en un termociclador y es especialmente útil para la detección de patógenos en semillas, aunque también es ampliamente utilizado para detectar patógenos en plantas enfermas, toxinas y residuos de pesticidas. Una de las ventajas de esta técnica es que se puede detectar la presencia del patógeno en el cultivo antes de que se presentes signos y síntomas de la enfermedad (De Boer y López, 2012).

Los marcadores RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA, fragmentos polimórficos de ADN amplificados al azar) cuando se utilizan para la identificación de patógenos, por ejemplo, en los hongos permiten el estudio de la variabilidad genética al identificar las diferencias entre los distintos organismos, siendo una herramienta muy importante para aislar marcadores moleculares y diseñar “primer” o iniciadores más específicos (Rigotti et al., 2002). Entre sus desventajas está el hecho de que tiene problemas de reproducibilidad.

Los marcadores RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) permiten el estudio genético de poblaciones y tiene una alta especificidad y no tiene problemas de reproducibilidad, pero requiere de más experiencia que el RAPD.

Los marcadores AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) permiten determinar la variabilidad intraespecífica en diferentes especies, es rápido y eficiente, pero requiere de gran experiencia y tiene los mismos problemas analíticos que el RAPD.

En la actualidad, hay kits rápidos de diagnóstico de enfermedades de varias casas comerciales que se basan en marcadores bioquímicos para la detección de hongos, bacterias y virus. La ventaja de estos kits es la rapidez y sencillez del sistema que lo hace una herramienta muy útil para el diagnóstico preliminar de la enfermedad.

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Cap. 1
   Enfermedades. Técnicas de diagnóstico de enfermedades en los cultivos
Cap. 2
   Enfermedades. Ejemplos de diagnóstico de enfermedades en hortícolas. Casos en pimiento, lechuga, calabacín y tomate