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MÉTODOS OFICIALES DE ANÁLISIS DE VINOS. (3ª parte)

A. Legislación Vigente Sobre Los Métodos Oficiales De Análisis De Vinos
A.1. Reglamento De La (Cce) Para La Determinación De Los Métodos De Análisis Aplicados En El Sector Del Vino
B. Métodos Empleados En Análisis De Vinos
1. Determinación De Masa Volumétrica Y Densidad Relativa
2. Grado Alcohólico Volumétrico
3. Extraco Seco
4. Azúcares Reductores
5. Sacarosa
6. Glucosa Y Fructosa
7. Cenizas
8. Alcalinidad De Cenizas
9. Cloruros
10. Sulfatos
11. Acidez Total
12. Acidez Volátil
13. Ácido Tartánico
13.1 Método Gravímetro
14. Ácido L-Málico
15. Ácido Cítrico
16. Ácido Láctico
17. Ácido L-Málico
18. Ácido Sórbico
18.1. Determinación Por Espectrofotometría De Absorción En El Ultravioleta
18.2. Método De Determinación Por Cromatografía En Fase Gaseosa
18.3. Método De Detección De Trazas De Ácido Sórbico Por Cromatografía De Capa Fina
19. Ácido L-Ascórbico
19.1. Método Colorímetro
20. Ph
21. Dióxido De Azufre
22. Sodio
23. Potasio
23.1. Método Por Fotometría De Llama
24. Magnesio
25. Calcio
26. Hierro
27. Cobre
28. Cadmio
29. Plata
30. Cinc
31. Fluoruros
32. Dióxido De Carbono
33. Ciano-Derivados
33.1. Método De Ensayo Rápido
34. Isotionato De Alilo
35. Índice De Folin-Ciocalteu



 
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15. ÁCIDO LÁCTICO

En presencia de nicotinamida -adenin-dinucleótido (NAD) el ácido láctico total (L-lactato y D-lactato) se oxida a piruvato mediante una reacción que es catalizada por L-lactato deshidrogenasa (L-LDH) y D-lactato deshidrogenasa (D-LDH).
El equilibrio de la reacción se desplaza en el sentido del lactato. La eliminación del piruvato del medio de reacción desplaza el equilibrio hacia la formación de piruvato.
En presencia de L-glutamato, el piruvato se transforma mediante una reacción catalizadora en L-alanina esta reacción catalizadora es llevada a cabo por la glutamato-piruvato-transaminasa (GTP). L-lactato+NAD+piruvato+NADH+H+D-lactato+NAD+piruvato+NADH+H, 3 piruvato+L-glutamato, L-alamina+acetoglutamato.
La formación de NADH que se mide por el muestreo de absorbancia a una longitud de onda de 340nm es siempre proporcional a la cantidad de lactato presente.
El ácido L-láctico se determina mediante dos reacciones:
El ácido láctico, separado mediante una columna separadora de aniones, pasa a oxidarse a etanol y es determinado por colorimetría después de que halla reaccionado con nitroprusiato y pipesidina.

Reactivos

1.Solución tampón pH= 10
2.Solución de nicotinamida-adenin-dinucleótido (NAD) de alrededor de 40 a 10 y 3M, se disuelven 900g en 30 ml de agua destilada. Se mantiene estable la solución hasta 1 mes aproximadamente a una temperatura de 4 ºC.
3.Suspensión glutamato-piruvato-transaminasa (GPT) de 20 mg/ml.
4.Suspensión de L-lactato deshidrogenasa (L-LDH) de 5mg/ml.

Material

- Espectrofotómetro con mediciones de 340nm, máximo de absorción de la NADH.
- Cubetas de vidrio de 1 cm de trayecto óptico.
- Micropipetas.

Proceso

Si la concentración de ácido láctico es menor a 100mg/l, la concentración de lactato se efectúa directamente sobre el vino, pero si no diluir con agua bidestilada.
Determinación del ácido láctico.
La solución tampón se lleva a una temperatura entre 20 a 25 ºC antes de proceder a la dosificación. Se ajusta la longitud de onda a 340nm. Posteriormente se introducen en las cubetas de vidrio las siguientes soluciones:
Una vez preparada la solución muestra y blanco, se mezcla con un agitador de vidrio y pasados unos 5 minutos se miden las absorbancia de la solución blanco y muestra.
Se añaden 0.02 ml de (L-LDH) y 0.05 ml de (D-LDH), se mezcla y se espera a que finalice la reacción y se miden las absorbancia.
Por último se determina las diferencias de absorbancia para el blanco y la muestra.
Diferencia absorbancia blanco (DAB).
Diferencia absorbancia muestra (DAM).
DA= DAM.DAB determinación del ácido L-láctico y del ácido D-láctico.
La concentración del ácido láctico se expresa en (g/l) con 1 decimal.

Método de cálculo

Fórmula general
1. V= volumen total en mml de ácido L-láctico.
2. V= volumen total en mml de ácido D-láctico.
3. v= volumen de la muestra en mml.
4. PM= peso molecular de la sustancia que se va a determinar.
5. EeE= coeficiente de excitación de la NADH a 340nm.
C= 0.164.DA.

16. ÁCIDO L-MÁLICO




Fundamento del método


En presencia de nicotamina-adenin-dinucleótido (NAD) el ácido L-málico (L-malato) se oxida y pasa a oxaloacetato en una reacción catalizada por la L-malato-deshidrogenasa (L-.MDH).
El equilibrio de la reacción se desplaza en sentido de malato. La eliminación del oxalato de la reacción desplaza el equilibrio a la formación de oxaloacetato. En presencia de L-glutamato el oxaloacetato se transforma en L-aspartato, que es una reacción catalizada por (GOT) glutamato-oxaloacetato-transminasa.
(1) L-malato+NAD+oxaloacetato+NADH+H+
La formación de NADH, medida por el aumento de la absorbancia con longitud de onda de 340nm es proporcional a la cantidad de L-malato presente.

Reactivos

1.Solución tampón pH= 10.
2.Solución de nicotamina-adenin-dinucleótido (NAD). Se disuelven 420mg de NDA en 12 ml de agua bidestilada manteniéndolo en solución estable durante 1 mes a 4 ºC.
3.Suspensión del glutamato-oxaloacetato (GOT9 de 2 mg/ml.
4.Suspensión de L-malato-deshidrogenasa (L-MDH) de 5 mg/ml.

Material

- Espectrofotómetro de medidas de longitud de onda de 340nm.
- Cubetas de vidrio.
- Micropipetas.

Proceso

Se ajusta la longitud de onda del espectrofotómetro realizándose las medidas de absorbancia en cubetas de 1 cm de trayecto óptico con respecto al agua.

Método de cálculo

(Se procede igualmente que en el caso de ácido láctico. Del apartado 16)

17. ÁCIDO D-MÁLICO

Fundamento

En presencia de D-malato deshidrogenasa decarboxil (D-MDH) el ácido D-málico (D-malato) se oxida a oxalacetato con la nicotinamida-adenin-dinucleótido (NAD). El oxalacetato que se ha formado se transforma posteriormente en piruvato y ácido carbónico .
D-malato+NAD+piruvato+CO2+NADH+H.
La formación de NADH, medida por el aumento de la absorbancia a una longitud de onda de 334nm, 340nm y 365nm es proporcional a la cantidad de D-malato presente.

18. ÁCIDO SÓRBICO

18.1 Determinación por espectrofotometría de absorción en el ultravioleta

El ácido sórbico se separa por destilación de arrastre de vapor de agua determinado en el destilado mediante la espectrofotometría de absorción en ultravioleta. Los contenidos inferiores a 20 mg/l deben confirmarse por cromatografía en capa fina.

Reactivos

1.Ácido tartánico C4H6O6 cristalizado.
2.Solución 0.02M de hidróxido de calcio Ca(OH)2.
3.Solución de referencia de ácido sórbico de 20mg/l.
Se disuelven 20g de ácido sórbico en 2 ml aproximadamente de solución molar 0.1M. Se vierte en un matraz aforado de capacidad 1000ml y se enrasa con agua hasta 1000ml.

Material

- Aparato de destilación con arrastre de vapor de agua.
- Baño de agua a 100 ºC.
- Espectrofotómetro con medidas de longitud de onda de 256nm.

Proceso

Destilado: Se introduce en el borboteador de arrastre de agua; 10 ml de vino y se añaden de 2 a 3 gotas de ácido tartánico.

Curva patrón: Se realizan 4 soluciones de referencia con unas cantidades de 0.5, 1, 2.5 y 5 mg respectivamente de ácido sórbico. Se mide con el espectrofotómetro las absorbancias a una longitud de onda de 256nm. Como resultado aparece una relación lineal.
Se introduce una cápsula con 5 ml de destilado, se añade 1 ml de hidróxido de calcio y una gota de sulfato de cobre. Posteriormente la solución se evapora mediante un baño de agua.
Se lleva una cantidad de muestra de 70 ml y se enrasa con agua de lavado. Se mide la absorbancia en una solución testigo a 256nm. La solución testigo es obtenida a partir de 1 ml de hidróxido cálcico y dilución a 20 ml de agua.

Método de cálculo

La concentración de ácido sórbico de vino expresad en mg/l es igual a 1000 x C donde C representa la concentración de ácido sórbico de la solución analizada mediante espectrofotometría.

18.2 Método de determinación por cromatografía en fase gaseosa

Reactivos

1.Éter etílico (C2H5)O2 destilado en el momento de su utilización.
2.Solución del patrón interno y solución del ácido undecanoico C11H22O2 en etanol al 95% vol g/l.
3.Solución acuosa de ácido sulfúrico H2SO4 en una cantidad de 1.84g/l.

Material

- Cromatografía de gases equipado mediante un detector de ionización de llama con columna de acero inoxidable.
- Microjeringa.
Para el tratamiento con dimetil cloro (DMDCS), se hace pasar por la columna una solución de tolueno, lavándose de inmediato la columna con metanol y secándola con una corriente de nitrógeno. Posteriormente se rellena la columna.

Proceso

Se añaden 20 ml en un tubo de vidrio provisto de un tapón. Se añaden 2 ml de solución de patrón interno y 1 ml de solución diluida de ácido sulfúrico.
(1) Se agita el tubo y se añade una cantidad de 10 ml de éter etílico . El ácido sórbico se extrae en la fase orgánica agitando el tubo durante 5 minutos.
Se selecciona el vino cuyo cromatograma de extracto etéreo no presente ningún pico de ácido sórbico. Se añade al vino ácido sórbico hasta alcanzar una concentración de 100 mg/l.
Se inyecta sucesivamente en el cromatógrafo (2) de la fase etérea obtenida en (1) y se realiza la cromatografía.
Hay que comprobar la presencia de ácido sórbico y patrón interno. Se mide la altura de cada uno de los picos registrados.

Método de cálculo

La concentración de ácido sórbico, viene expresada en mmg/l.
H= altura del pico del ácido sórbico en la solución de referencia.
h= altura del pico del ácido sórbico en la muestra para análisis.
I= altura del pico del patrón interno en la solución de referencia.
i= altura del pico del patrón interno para muestra de análisis.

18.3 Método de detección de trazas de ácido sórbico mediante cromatografía de capa fina

Reactivos

1.Éter etílico (C2H5)O2.
2.Solución acuosa de ácido sulfúrico H2SO4.
3.Solución de referencia de ácido sórbico en una mezcla hidroetanica a 10% de etanol (vol).aproximadamente unos 20 mg de etanol.
4.Fase móvil hexano-pentano-ácido acético C6H14-C5H2-CH3COOH.

Material

- Placas para cromatografía de capa fina de 20x20 recubiertas donde se les añadirá un indicador de fluorescencia.
- Cubeta para cromatografía.
- Micropipeta o microjeringa.
- Lámpara de ultravioleta.

Proceso

Se introducen 10 ml de vino en un tubo de vidrio, se añade 1 ml de solución de ácido sulfúrico diluido y 5 ml de éter etílico. Se agita y se deja decantar. Por último se prepara las soluciones diluidas de 2, 4, 4, 8 y 10 mg/l de ácido sórbico.
Cromatografía: Con una jeringa o micropipeta se deposita una cantidad de 2 cm de fase etérea obtenida en una de las dos placas y también una cantidad de 5 l. de cada una de las soluciones diluidas. La distancia entre los puntos será 2 cm.
Se introduce la fase móvil en la cubeta de cromatografía y se coloca la placa en la cubeta. Se deja desarrollar el cromatograma entre 12 a 15 cm un tiempo aproximado de 30 minutos. Posteriormente las placas se secan bajo una corriente de aire frió. El cromatograma se examina bajo una lámpara ultravioleta a 250nm.
Las manchas de ácido sórbico, de color oscuro, destacan sobre el fondo amarillo de la placa La comparación entre la intensidad de la mancha de la muestra para analizar y las manchas de las soluciones de referencia permiten evaluar la concentración de ácido sórbico entre 2-10 mg/l.

19. ÁCIDO L-ASCÓRBICO

Fundamento del método.

El método aquí empleado determina el ácido L-ascórbico dehidroascórbico presentes en el vino.
Este ácido se oxida por acción del carbón activo a ácido dehidroascórbico. El ácido dehidroascórbico forma un compuesto fluorescente por su reacción con la ortofenilendiamina (OPDA) mediante la realización de una prueba testigo con ácido bórico se determina la fluorescencia.

Reactivo

1.Solución de hidrocloruro de ortofenilendiamina a 0.02g/100ml (C6H10Cl2N2).
2.Solución compuesta de ácido bórico y cromato de sodio.
3.Solución de ácido acético cristalizado al 56% con pH =1.2.
4.Solución de ácido L-ascórbico de 1g/l (C6H8O6)
5.Carbón activo puro.

Material

- Fluorímetro.
- Filtro de vidrio poroso.
- Tubos de ensayo.
- Agitador para tubos.

Proceso de preparación de la muestra

Se ponen en un matraz de 100ml de vino y se enrasa con ácido acético. Se homogeneiza el contenido del matraz agitando y se añaden 2g de carbón activo, dejándolo reaccionar un tiempo de 15 minutos. Por último se pasa por papel de filtro.
Se introducen en dos matraces aforados de capacidad 100ml, 5ml de filtrado y 5 ml de solución mixta de ácido bórico y malato de sodio. Se dejan 15 minutos en contacto y se enrasan con agua.
Se extraen 2ml de cada uno de los matraces y se le añaden una cantidad de 5 ml de ortofenilendiamina y se agita. Debe de permanecer en reposo media hora y en oscuridad. Posteriormente se mide con el espectrofotómetro.
Se introducen 2, 4 y 6 ml en tres matraces de solución de ácido L-ascórbico y se emplea con ácido acético hasta 100ml y se agita hasta homogeneizar la solución.
Se añaden 2g de carbón activo en cada uno de los matraces y se dejan 15 minutos agitando de vez en cuando , se filtra y se añade 5 ml de cada filtrado en matraces añadiendo posteriormente una solución de 5ml de ácido bórico y de acetato de sodio y a los matraces de segunda serie se le añaden 5ml de acetato de sodio.
Se dejan 15 minutos en contacto y se enrasan con agua hasta 100ml. Se extraen 2 ml de cada matraz y se le añaden 5 ml de ortofenilendiamina , se agita y se deja 30 minutos en oscuridad y se mide con el espectrofluorímetro.
La curva patrón que se obtiene de las medidas del espectrofluorímetro, debe ser una curva de regresión lineal y que pase por el punto origen.
La concentración de ácido L-ascórbico más ácido dehidroascórbico en el vino se expresa en mmg/l.

19.1 MÉTODO COLORÍMETRO

Reactivos

1.Solución de ácido metafosfórico al 30% (m/v).
2. Solución de ácido metafosfórico al 3% (m/v).
4. Solución de ácido metafosfórico al 1% (m/v).
5. Suspensión de poliamida.
6. Tiourea.
7. Solución 0.05M de yodo (I2).
8. Solución dinitrofenilhidrazina al 6% (m/v).
9. Acetato etílico.
10. Cloroformo CHCl3.
11. Solución acuosa de almidón al 0.5% (m/v).
12. Fase móvil de acetato etílico.
13. Ácido acético glacial.
14. Solución de ácido L-ascórbico de 0.1g por cada 100ml de solución.
15. Tubos de centrifugación.
16. Baño de agua refrigerada a 20 ºC.
17. Placas de cromatografía en agua de 20x20.
18. Cubetas para cromatografía.
19. Micropipetas.
20. Oxidación del ácido L-ascórbico en ácido dehidroascórbico.

Proceso

(1) Se introduce 50ml de vino en un matraz de 100ml, se añade 15ml de poliamida y se enrasa con ácido metafosfórico 3%. Tras un tiempo de reposo se filtra y se introducen 20ml de filtrado y se centrifugan y se añade 1 ml de (I2) 0.05M, se agita y tras 1 minuto se reduce el exceso de yodo con 25mg de tiourea.
Se realiza un nuevo preparado para la extracción y formación de las bis 2,4 dinitrofenilhidrazona del ácido dicetogulónico.

(2) Se introduce en la placa inferior del calorímetro 0.2ml de extracto de acetato de etilo. Se introduce la fase móvil en la cubeta hasta una altura de 1cm. Se introduce la placa hasta que el disolvente cubra todo su borde superior. Aparece una coloración roja sobre ella que es típica de las bis (2,4-dinitrofenilhydrazona) que se rasgan con una espátula para quitarlas de la placa. Se recogen los residuos y se posan en un erlenmeyer y se añaden 4ml de ácido acético, se dejan 30 minutos y se filtran con papel de filtro sobre la cubeta del espectrofotómetro. Se mide la absorbancia de la solución para obtener la curva patrón.

(3) En tres matraces aforados se introducen igualmente 5, 10 y 15ml de ácido L-ascórbico se enrasa con ácido metafosfórico al 1% y se trata cada una de estas soluciones según el procedimiento (1) y (2) y se traza la curva patrón

Cálculo

La curva patrón se lleva a la lectura realizada en el apartado de (3) y se lee la concentración de ácido ascórbico + ácido dehidroascórbico de la solución analizada.


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