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Trichoderma en los microorganismos no patógenos descomponedores de la materia orgánica

Los microorganismos son los componentes más importantes del suelo. Constituyen su parte vital y son los responsables de la dinámica de transformación y desarrollo.
 

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EFECTOS DE Trichoderma (in vitro) EN LOS MICROORGANISMOS NO PATÓGENOS DESCOMPONEDORES DE LA MATERIA ORGANICA DE UN SUELO OXISOL CLASE IV DEL PIEDEMONTE LLANERO

Resumen.
1. Introducción.
2. Metodología.
2.1. Localización.
2.2. Recolección o toma de las muestras de suelo.
2.3. Procedimiento de laboratorio.
2.4. Diseño experimental.
2.5. Análisis estadístico.
3. Resultados.
4. Discusión.
5. Conclusiones.
6. Recomendaciones.
7. Bibliográfia.

RESUMEN

Los microorganismos son los componentes más importantes del suelo. Constituyen su parte vital y son los responsables de la dinámica de transformación y desarrollo. La diversa cantidad de microorganismos que se encuentran en una fracción del suelo cumplen funciones determinantes en la transformación de los componentes orgánicos e inorgánicos. En el suelo existe un equilibrio microbiológico en donde naturalmente las poblaciones se autorregulan.

En los últimos años se ha venido utilizando en la agricultura el uso de Trichoderma, como controlador de patógenos del suelo, dando buenos resultados como antagonista, pero este alto poder antagónico puede alterar el equilibrio microbiológico que existe en el suelo.

Por lo anterior se hizo necesario realizar pruebas de confrontación o pruebas antagónicas (in Vitro) en el laboratorio de Microbiología Vegetal de la Universidad de los Llanos, con el fin de determinar el tipo de interacción de dos cepas, Trichoderma harzianum y Trichoderma viride, con aislamientos de los hongos Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus repens, Mucor petrinsularis, Penicillium parvum, Rhizopus cohnii y las Bacterias, Pseudomonas sp y Bacillus sp, microorganismos benéficos descomponedores de la materia orgánica de un suelo Oxisol clase IV. La cepa de Trichoderma viride se aisló de los lotes comerciales de la granja Universidad de los Llanos, vereda Barcelona, Villavicencio Meta. Y la cepa de Trichoderma harzianum, es propiedad del laboratorio de microbiología y fitopatología de la Universidad de los Llanos. Discos de Micelio de cada hongo se colocaron en los extremos de una placa o caja de petri con medio agar, papa, y dextrosa (PDA) (En caso de los hongos). Para todos los enfrentamientos se realizaron tres (3) repeticiones y el material fue incubado en condiciones de laboratorio (26º – 28º C y 12/12 horas. Luz-oscuridad). En el caso de las bacterias se colocaron cuatro (4) discos de micelio del hongo Trichoderma, simulando un cuadrado sobre la placa o caja de petri con medio PDA + Agar Topping, (relación 1:1). Las cepas de Trichoderma harzianum y Trichoderma viride., en la interacción con los Microorganismos benéficos descomponedores de la materia orgánica, se evaluó: crecimiento micelial (observación macroscópica) e interacciones entre las hifas (observaciones microscópicas). En el caso de las Bacterias, interactuando con Trichoderma se llevaron acabo solo observaciones macroscópicas. Los resultados indican que las cepas de Trichoderma harzianum y Trichoderma viride, presentaron gran capacidad antagónica por su alta velocidad de crecimiento, alta competencia por espacio y limitación del crecimiento de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus repens, Mucor petrinsularis, Rhizopus cohnii y las bacterias Pseudomonas sp y Bacillus sp. El crecimiento de Penicillium parvum no fue impedido por ninguna de las dos cepas de Trichoderma.

Se concluye que Trichoderma harzianum y Trichoderma viride, son microorganismos con alta velocidad de crecimiento, alta competencia por espacio y por consiguiente pueden alterar el crecimiento de los hongos y bacterias que descomponen la materia orgánica del suelo, reduciendo la población microbial y de esta manera posiblemente disminuyendo los procesos biológicos.

1. INTRODUCCIÓN

Los Hongos, Bacterias y Actinomicetos del suelo son trabajadores anónimos que hacen que este sea fértil, descomponiendo la materia orgánica hasta la más mínima expresión, haciendo posible la absorción de muchos compuestos y elementos por parte de las plantas.

Un suelo fértil es aquel que tiene una gran biodiversidad de microorganismos, que con sus actividades liberan nutrientes en forma permanente para alcanzar un balance que permita un buen desarrollo vegetal, y de forma natural se dan interacciones entre los microorganismos, regulándose entre sí las poblaciones; El hombre se ha fijado en ellas y las está manejando en sus prácticas agrícolas, bajo el nombre de agricultura biológica, en donde manipula un organismo para contrarrestar otro organismo, pero poco mide la magnitud de está interacción, y esto me conlleva a pensar que la utilización del hongo Trichoderma en la agricultura biológica por su agresividad antagónica contrarresta no solo microorganismos patógenos del suelo, sino también, microorganismos no patógenos descomponedores de la materia orgánica del suelo. Las especies de Trichoderma más utilizados son: T. harzianum y T. viride, según la literatura estos tienen un alto poder antagónico; por tal razón a continuación el principal objetivo fue identificar el efecto de estas dos especies en algunos microorganismos benéficos descomponedores de la materia orgánica de un suelo Oxisol, clase IV del piedemonte Llanero.

2. METODOLOGÍA

2.1. Localización

Este trabajo se realizó en la Granja Universidad de los Llanos, Vereda Barcelona, Latitud Norte de 4º 3’ y longitud Oeste de 63º 38’, altura 387 m.s.n.m, precipitación anual promedio 3.479. mm, humedad relativa 82%, temperatura media anual 25.2 ºC, temperatura máxima anual 32.5 ºC, temperatura mínima anual 18.5 ºC, y en las instalaciones del laboratorio de microbiología vegetal y fitopatología, de la Universidad de los Llanos. Villavicencio Meta.

2.2. Recolección o toma de las muestras de suelo

Las muestras se tomaron del lote de cultivos comerciales, de la granja Unillanos Vereda Barcelona, este lote tiene aproximadamente 4.5 hectáreas. Se recolectaron 5 submuestras por hectárea, a una profundidad de 20 cm., con un peso de 250 gramos de suelo cada una, las 5 submuestras se tomaron sistemáticamente en forma de X en la hectárea, estas muestras fueron llevadas a un recipiente de plástico, se mezclaron rápidamente y se tomó un (1) kilogramo de suelo (por Hectárea), esta muestra se almacenó en bolsa plástica transparente, dejando un espacio libre dentro de la bolsa como cámara de aire, luego se empacaron en papel manila y se colocaron en la nevera a una temperatura entre 18 y 20 ºC. La recolección de estas muestras se hizo en las 4.5 hectáreas. El numero de muestras a analizar: Una por hectárea. (Total: 4).

Observación: Las muestras de suelo se deben tomar lo más cerca posible al sistema radicular del cultivo que este establecido en dicho lote.

2.3. Procedimiento de laboratorio

Se pesaron 10 gramos de suelo (por muestra, el suelo debe estar a capacidad de campo), luego se colocaron en un erlenmeyer que contenga 90 ml de agua destilada estéril, Posteriormente se agitaron por 20 a 30 minutos; Se traspasaron 1 ml o (0.1 ml) de esta solución a tubos de ensayos que contengan 9 ml o (0.9 ml sí utilizo tubos ependors para trabajar con micro pipetas) de agua destilada estéril. Agitar por un minuto y transferir a otro tubo de ensayo que contenga 9 ml o 0.9 ml de agua destilada estéril (método de diluciones). Repetir este procedimiento, hasta alcanzar las diluciones deseadas. Las diluciones apropiadas son: 0.0001 y 0.00001 para bacterias, observar a las 24 y 48 horas; 0.00001 y 0.000001 para hongos, observar en 72 y 96 horas. Colocar 1 ml o 0.9 ml da cada dilución sobre la superficie de un medio de cultivo especifico y con ayuda de un rastrillo estéril realizar un movimiento rotatorio con el fin que el ml de agua tomado de la dilución quede bien distribuido en toda la superficie de la caja. Se Incubaron por 2-3 días entre 26 y 28 ºC para realizar un recuento de colonias. Después de hacer las observaciones macroscópicas y microscópicas se identificaron los hongos: Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Penicillium parvum, Aspergillus repens, Mucor petrinsularis y Rhizopus cohnii.; las bacterias: Bacillus sp., y Pseudomonas sp.; Se establecieron los cultivos puros de cada microorganismo, se hicieron las pruebas antagónicas entre el hongo Trichoderma y los microorganismos anteriormente mencionados (Se uso Trichoderma viride y T. harzianum). Cada organismo se sembró en su medio específico y estuvo acompañado del hongo Trichoderma. Por tres repeticiones.

En el caso de los hongos:

En una caja de petri con medio de cultivo especifico PDA; en uno de sus extremos se sembró Trichoderma y en el otro extremo opuesto se sembró el hongo benéfico (Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Penicillium parvum, Aspergillus repens, Mucor petrinsularis y Rhizopus cohnii), uno a uno, para cada hongo se sembró un disco de micelio (de 6 mm de diámetro) o partes iguales, se delimito el centro de la caja de petri con una laminilla que sirvió de regla y de guía para determinar quien invade más rápido el medio, se hicieron observaciones macroscópicas y microscópicas para determinar interacciones entre ellos. (Se debe hacer para todos los hongos por tres repeticiones).

En el caso de las Bacterias:

En una caja de petri que contenga medio de cultivo especifico para Bacterias y para Trichoderma (Mezclar PDA y Agar Topping en proporción 1:1); se sembró la bacteria en todo el medio esparciéndola con el rastrillo y se colocaron encima cuatro disco de micelio (de 6 mm. Aproximadamente de diámetro) del hongo Trichoderma, uniformemente distribuidos, simulando un cuadro dentro de la caja petri; se hicieron observaciones macroscópicas para determinar interacciones entre los dos microorganismos. (Se realizo para Bacillus sp. y Pseudomonas sp., por tres repeticiones).

a) Medios de cultivos y disoluciones:

- Bacterias: Glucosa- Peptona, Extracto de levadura y agar (GPLA) o (Agar Topping). Disoluciones: 0.0001 y 0.00001. pH: 6.8 - 7.2.
- Hongos: Papa, Dextrosa y Agar (PDA). Disoluciones: 0.00001 y 0.000001. pH: 5.5.

b) Las cajas con los cultivos se encubaron en condiciones de laboratorio (26º a 28ºC y 12/12 horas. Luz-Oscuridad), por cuatro meses. En este periodo de incubación, se identificaron los efectos o interacciones que existen entre el hongo Trichoderma y los demás microorganismos.

2.4. Diseño experimental

Dado que el trabajo de investigación se realizo bajo condiciones controladas se utilizo el diseño completamente al azar, utilizando tres repeticiones.
Se usaron: Una cepa de Trichoderma viride y otra de Trichoderma harzianum, frente a 7 (siete) hongos, y 2 (dos) bacterias.

2.5. Análisis estadístico

Los datos obtenidos en cada una de las repeticiones o enfrentamiento del hongo Trichoderma con los demás microorganismos, se organizaron mediante la estadística cualitativa. Para una mayor interpretación de datos se usaron fotografías etc.

3. RESULTADOS

La cepa de Trichoderma viride, utilizada para evaluar sus efectos sobre los microorganismos no patógenos descomponedores de la materia orgánica de un suelo Oxisol clase IV del Piedemonte Llanero, fue aislado de los Lotes comerciales de la granja UNILLANOS, Vereda Barcelona. Villavicencio Meta (Figura: 1). Y la cepa de Trichoderma harzianum, evaluada corresponde a una cepa comercial del laboratorio de microbiología vegetal y fitopatología de la Universidad de los Llanos (Figura: 2).

Figura 1. Trichoderma viride.
Figura 2. Trichoderma harzianum.

Los microorganismos no patógenos descomponedores de la materia orgánica presentes en las muestras de suelo son:

HONGOS: Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Penicillium parvum, Aspergillus repens, Mucor petrinsularis y Rhizopus cohnii.
BACTERIAS: Bacillus sp., y Pseudomonas sp.

Para el caso Trichoderma. En la interacción con. A. fumigatus, A. Flavus, A. niger, A. repens, M. petrinsularis y R. cohnii. Trichoderma inhibió o limito el crecimiento de estos hongos. Según observaciones macroscópicas el micelio de Trichoderma harzianum y T. viride. Invade rápidamente los medios de cultivo, compitiendo por espacio y alimento, en un lapso de 40 a 90 horas de incubado. Observaciones hechas a los 2 y 3 meses de incubación de los hongos se encontró que Trichoderma era el único microorganismo existente en el medio de cultivo contenido en las cajas de petri (Figura: 3, 4, 5 y 6). En las observaciones microscópicas en los objetivos 40x y 100x, no se encontraros interacciones de lisis, predación, estrangulación y parasitismo. No existen interacciones negativas entre las hifas de estos hongos (Figura: 7, 8, 9 y 10).
Figura 3. T. harzianum vs R. cohnii. A las 40 horas de incubación.
Figura 4. T. harzianum vs R. cohnii. A los 2 meses de incubación.
Figura 5. T. viride vs A. niger. A los 5 días de incubación.
Figura 6. T. viride vs A. niger. A los 3 meses de incubación.
Figura 7. T. harzianum vs. A. fumigatus.
Figura 8. T. viride vs A. repens (40x)
Figura 9. T. harzianum vs P. parvum.
Figura 10. T. viride vs P. parvum (40x)

El crecimiento de Penicillium parvum, no se vio limitado por las dos cepas de Trichoderma. A. fumigatus. T. harzianum. A. repens. P. parvum T. harzianum. P. parvum. T. viride. T. viride. En el caso de Trichoderma. Interactuando con. Bacillus sp y Pseudomonas sp. Trichoderma inhibió o limito el crecimiento de las Bacterias. (Figura: 13, 14, 15 y 16).

Figura 11. Bacillus sp. vs T. viride. A las 24 horas de incubación.
Figura 12. Bacillus sp. vs T. viride. A los 10 días de incubación.
Figura 13. Pseudomonas sp. vs T. harzianum. A las 24 horas de incubación.
Figura 14. Pseudomonas sp. vs T. harzianum. A las 72 horas de incubación.

4. DISCUSIÓN

En las pruebas antagónicas o pruebas de confrontación de Trichoderma harzianum y Trichoderma viride, contra los aislamientos de los Hongos, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus repens, Mucor petrinsularis, Rhizopus cohnii, Penicillium parvum y las Bacterias, Pseudomonas sp y Bacillus sp; se presento por parte de Trichoderma una alta velocidad de crecimiento, alta competencia por espacio, produciendo posiblemente enzimas, como lo reportan los autores (Lorito et al, 1994; Harman, 2001; Ordoñez, 2000.), con base a esto se vio limitado el crecimiento de los microorganismos descomponedores de la materia orgánica del suelo, con excepción de Penicillium parvum que no fue impedido su crecimiento.

Muchos microorganismos tienen la capacidad de producir antibióticos en medio de cultivo y bajo condiciones de campo, lo cual es la más fuerte evidencia de la posible acción de este tipo de compuestos como mecanismo de antagonismo de Trichoderma, la competencia entre organismos siempre ha existido más aun cuando se trata de agentes de control biológico, que limitan el crecimiento, desarrollo y colonización rápida del sustrato.

Trichoderma
como agente de control biológico, tiene la capacidad de colonizar o adaptarse a varias clases de sustratos, en condiciones controladas (in Vitro) demostró adaptabilidad a los medios de cultivo utilizados y gran destreza para competir por el espacio y posiblemente por el alimento, dando como resultado una inhibición o limitación del crecimiento de los organismos que fueron confrontados; si esto sucede “in vitro”, debe suceder en condiciones de campo, ya que la competencia entre organismos siempre ha existido en la naturaleza.

Los Hongos y Bacterias del suelo son microorganismos importantes en el ciclaje de la energía y nutrientes (Primavessi Ana 1982, Baker R 1988, Burbano H. 1989). Trichoderma es un hongo altamente antagónico (Baker 1985). Entonces las altas aplicaciones de Trichoderma posiblemente pueden alterar las poblaciones de hongos y bacterias que hay en el suelo.

Trichoderma spp tiene diversas ventajas como agente de control biológico, pues posee un rápido crecimiento y desarrollo, a parte de esto produce una gran cantidad de enzimas, inducibles con la presencia de hongos fitopatógenos. Puede desarrollarse en una amplia gama de sustratos, lo cual facilita su producción masiva para uso en la agricultura. Su gran tolerancia a condiciones ambientales extremas y a hábitats donde los hongos causan enfermedad le permiten ser eficiente agente de control, de igual forma puede sobrevivir en medios con contenidos significativos de pesticidas y otros químicos. Su gran variabilidad lo constituye en un reservorio de posibilidades de control biológico bajo diferentes sistemas de producción y cultivos (Trosmno 1989, citado por Tronsmo y Hhjeljord, 1998). Se puede conjeturar que Trichoderma por su facilidad de colonizar sustratos y producir una amplia gama de enzimas, pude convertirse fácilmente en un organismo antagónico de muchos organismos benéficos que están en el suelo.

5. CONCLUSIONES

Las cepas de Trichoderma harzianum y Trichoderma viride, evaluadas, presentaron gran capacidad antagónica por su alta velocidad de crecimiento, demostraron ser unos organismos altamente agresivos en cuanto concierne a la competencia por espacio, inhibieron el crecimiento de los hongos, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus repens, Mucor petrinsularis y Rhizopus cohnii; y las bacterias, Pseudomonas sp y Bacillus sp. En cuanto al hongo, Penicillium parvum, este no se vio afectado por la competencia por espacio, Trichoderma harzianum y Trichoderma viride, crecen por encima del micelio de Penicillium parvum, sin inhibirle su crecimiento. Trichoderma harzianum y Trichoderma viride, son altamente competitivos por el espacio, por esta razón, inhiben el crecimiento de otros microorganismos y pueden disminuir una población de organismos en el suelo.

Las altas aplicaciones de Trichoderma a los lotes cultivados pueden disminuir las poblaciones de hongos no patógenos descomponedores de la materia orgánica, alterando el equilibrio biológico de los suelos y por consiguiente se disminuye la fertilidad de estos.

6. RECOMENDACIONES

Evitar altas aplicaciones de Trichoderma en las prácticas agrícolas, especialmente de especies desconocidas sin evaluar su efecto. Aplicar las dosis adecuadas de Trichoderma, por unidad de área, a los lotes cultivados. Hacer análisis microbiológico de los suelos y de acuerdo a la microflora presente, tomar las decisiones correctas, para cualquier aplicación de un producto, sea biológico o químico hay que tener en cuenta el equilibrio microbiológico del suelo.

7. BIBLIOGRAFIA

-
AGRIOS, G. N. 1995. Plant pathology. New York and London, academic Press. P 1978.
- AHMA, J. S. & BAKER, R 1987. Rhizosphera competence of Trichoderma harzianum. Phytopathology 77: 182-189.
- BAKER, R. 1985. Biological control of plant pathogens: definitions. P. 25-39. In M. A. Hoy and D. C. Herzog (Eds). Biological control in agricultural IPM systems. Academic Press. New York.
- BAKER, R; CHANG, Y. C; KLEIFIELD & CHET, I. 1986. Increased growth of plants in the presence of the biological control agent Trichoderma harzianum. Plant disease 70: 145-148.
- BAKER, R. 1988. Trichoderma sp. As plant growth stimulant. CRC Critical Reviews 7: 97-106.
- BELL, D.K., H. D. Well and MARKHAM, C. R. 1982. In vitro antagonism of Trichoderma species against six fungal plant pathogens. Phytopathology 72: 379-382.
- CHET & INBAR, J. 1994. Biological control of fungal pathogens. Applied biochemistry and biotechnology 48, 37-43.
- BURBANO, H. 1989. El suelo: Una visión sobre sus componentes bioorgánicos. 423 p.
- ELAD, Y. 1980. Trichoderma harzianum: a biocrontrol agent effective against Sclerotium rolfsii and Rhizoctonia solani. Phytopathology 70: 119-121.
- ESPOSITO, E. and Da-Silva M. 1998. Systematise and environmental application of the genus Trichoderma. Critical review in microbiology 24: 89-98.
- HARMAN, G. E. 2001. Trichoderma spp. Including Trichoderma harzianum, T. viride, T. koningil, T, hamatum and other spp. Deuteromycetes, moniliales (Asexual classification system) http: //www.birdhybrids.com/t-22.htm.
- GILMAN, Joseph C. Manual de los Hongos del Suelo. Compañía editorial CONTINENTAL S.A. México. Primera edición en español: Diciembre de 1963. 572p.
- KLEIFIELD, O. CHET, I. 1992. Trichoderma harzianum Interaction with plants and effect on growth response. Plant and soil. 144: 267-272.
- LORITO, M. 1998. Chytinolytic enzymes and their genes. En Kubicek, C.P. & Harman, G.E. (eds.), Trichoderma and Gliocladium vol. 2. Taylor and Francis, Londres (en prensa).
- SCHASD, N. W. 1998. Plant Pathology Bacteria. 2nd Edition. P 2-14. 158p.
- SILVA H. Maria Del Rosario. 2004. Guías de laboratorio Microbiología Vegetal: Aislamiento de Microorganismos del Suelo. Universidad de los Llanos.
- TRONSMO, A. & GORDON, L. 1998. Biological control with Trichoderma 111-126.
- ORDÓNEZ, V.H. 2000. Producción de enzimas microbianas y sus aplicaciones en la industria. Pp. 67-71. En: II congreso internacional de microbiología industrial. Pontificia Universidad Javeriana, Santa fé de Bogotá.
- PRIMAVESSI, A. 1982. Manejo ecológico del suelo. 1982. 499 p.
- WINDHAM, M. T.; ELAD & BAKER R. A. 1986. Mechanism for increased plant growth induced by Trichoderma spp. Phytopathology 76, 518-521.

AGRADECIMIENTOS:

Los autores expresan sus más sinceros agradecimientos a la Universidad de los Llanos, Laboratorio de Microbiología Vegetal y Fitopatología UNILLANOS, Al centro de Investigaciones de Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales UNILLANOS, especialmente al director AGUSTIN GONGORA ORJUELA, y al Instituto de Investigaciones de la Orinoquia Colombiana (I.I.O.C), a su director: PEDRO RENE ESLAVA MOCHA.

Autores:
Borrero Cesar A. Estudiante del Programa de Ingeniería Agronómica.
Silva H Maria Del Rosario. Docente Investigadora del programa de Ingeniería Agronómica de la Universidad de los Llanos orientales.



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